近年来，在FDA每年批准的新药中，抗体药物占据了约1/5。这些抗体药物对应的适应症中，肿瘤治疗仍是主流，其次是皮肤病和血液疾病。商业化抗体产品表现出靶点相对集中，居第一的是PD-1/L1，紧随其后的是CD20、TNF、HER2等热门靶点。

抗体药的研发，从最初的确定靶点，到筛选先导分子，做临床前研究，再到进入临床1/2/3期试验，以及完成最后的NDA申报，整个流程基本需要耗费10年时间。纵观整个抗体新药研发流程，先导抗体分子就是故事的开始。可以说，能够开发出针对特定靶点的先导分子的企业基本就拿到了新药研发的入场券。

当前比较常见的先导抗体产生的技术路线主要有：杂交瘤、抗体库和单个B细胞。其中杂交瘤技术和抗体库技术应用较早，单个B细胞技术起步略晚，相对新兴。

杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术：它的主要流程为先进行动物免疫，将特定的抗原注射到哺乳动物体内，使之脾脏内产生大量分泌针对该抗原的特异性抗体的B淋巴细胞。由于B淋巴细胞是一种终末未分化细胞，存活一段时间便会死亡，所以需要将B淋巴细胞与不分泌抗体却能在体外无限增殖存活的骨髓瘤细胞进行融合，产生具有两种细胞特性既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞。两种细胞融合后，会产生五种类型的细胞，分别是未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B淋巴细胞-B淋巴细融合体、骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体以及所需要的杂交瘤细胞。接下来便需要进行杂交瘤细胞的筛选，去除不需要的四种类型细胞。

杂交瘤技术原理示意图

杂交瘤细胞的筛选一般包含两步，首先用HAT培养基进行筛选， HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质。氨基喋呤可以对DNA的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在HAT培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于HAT培养基中培养，其他的融合结果会全部死亡，最终筛选出杂交瘤细胞。

其次进行单个杂交瘤细胞的筛选，将培养基稀释到多孔板中，使得每孔仅含有一个杂交瘤细胞，再由这些单细胞克隆生产，最终分泌出预定特异性抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

在进行单个杂交瘤细胞筛选时，通常采用有限稀释法或者半固体培养基法。对于有限稀释法来说，为符合FDA的申报要求，需进行两轮有限稀释（LDC），或者一轮LDC结合图像证明以验证单克隆性。有限稀释法工作量大，往往需要运用自动化工作站进行高通量筛选。

有限稀释法进行杂交瘤筛选的典型步骤

贝克曼库尔特的实验室自动化工作站，可以整合细胞计数、离心机、细胞成像等各类设备完成自动化、高通量的有限稀释功能，并且可以配置HEPA过滤外罩和无菌移液枪头，保持细胞生长的清洁环境。

贝克曼库尔特实验室自动化

工作站Biomeck i7进行有限稀释

采用自动化工作站进行有限稀释，还会得到良好的一致性，经过五次有限稀释，每次稀释四块96孔板后的重复实验数据显示，平均每块板的单克隆率一致性良好，且没有位置偏好。

五次实验中每次实验的

四块板上的平均单克隆率

二十次重复实验每孔的单克隆次数

半固体培养基法是细胞生长在半固体培养基中，形成单克隆细胞团，同时将目的蛋白分泌在细胞团周围。半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与目的蛋白特异性结合，当用一定波长的光进行激发时能发出荧光。如此，便可使用图像分析软件对单克隆细胞团的大小和荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团。

半固体培养基法进行杂交瘤筛选的典型步骤

丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器拥有ClonePix 2哺乳动物细胞克隆筛选系统，可用于杂交瘤细胞的筛选。ClonePix 2将单细胞识别和产率筛选整合在一起，而且提供克隆图像证据，将筛选时间从两轮减少到一轮，大大简化单克隆筛选流程。

美谷分子仪器的ClonePix 2 系统自动确定和挑取单细胞来源的克隆

抗体库技术经历了初期组合抗体库、噬菌体展示抗体库及核糖体展示抗体库三个阶段。初期组合抗体库是采用RT-PCR方法从淋巴细胞中克隆出抗体轻链和重链Fd段全套基因，并分别组建到表达载体中，感染大肠杆菌，得到轻链和重链基因库，再将轻链和重链基因随机重组到同一个表达载体中，形成组合抗体库。

噬菌体展示技术典型流程

随后，噬菌体抗体库迅速取代了组合抗体库，它是将外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，再通过淘洗和富集获得表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，进而获得目的抗体的技术。它的主要流程为：

1） 构建噬菌体展示库：从B淋巴细胞中扩增抗体的基因文库，插入到噬菌体的基因组中，使抗体片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面，形成噬菌体展示抗体库。

2） 抗体库淘选：将噬菌体文库与固定抗原孵育，洗涤未结合的噬菌体，接着再洗脱与抗原特异性结合的噬菌体。此过程需要重复3-4次，以富集到高亲和力的噬菌体。在筛选过程中一般需要采用ELISA或是WB的方法进行富集验证。

丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器的SpectraMax^® i3x多功能酶标仪，可选配SpectraMax^® MiniMax^™ 300细胞成像系统、Scanlater^™ Western Blot检测卡盒，配合相应试剂以及行业领先的数据获取和分析软件SoftMax Pro，在一台仪器上即可完成ELISA和Western Blot 实验。

SpectraMax^® i3x多功能酶标仪

3） 噬菌体感染与筛选：将高亲和力的噬菌体感染大肠杆菌，琼脂板铺板培养挑选出克隆。

噬菌体淘选后感染大肠杆菌，进行克隆挑选，手工挑选工作量巨大且容易出错。美谷分子的QPix系列高通量微生物克隆筛选系统可进行自动加样、涂布、挑取、复制、点样、文库重排的工作，能够减轻人力负担，且拥有高达3000个克隆/小时的挑取速度，可以满足高通量挑选的的要求。

美谷分子仪器的 QPix高通量微生物克隆筛选系统

QPix配套的分析软件可以利用克隆的大小、圆度、轴比以及克隆间距进行筛选，从而更加准确高效地挑取克隆。

高亮显示选取噬菌斑      

4） 抗体验证：筛选到合适的噬菌体之后，进行测序获得正确的序列进行抗体的表达。此时，需要进行抗体的亲和力测定及功能鉴定。

贝克曼库尔特本土创新的CytoFLEX系列流式细胞仪，可进行亲和力、CDC/ADCC/ADCP的效应功能分析。如进行亲和力的检测，可采用梯度稀释的IgG孵育同等细胞数的能表达特异性抗原的阳性细胞和不能表达特异性抗原的阴性细胞，再用PE-抗 IgG抗体来检测与阳性细胞结合的IgG抗体，通过检测平均荧光强度(MFI)计算抗体与靶细胞结合的平衡解离常数(KD)来判定亲和力的强弱。

流式检测亲和力模拟图

贝克曼库尔特的CytoFLEX系列流式细胞仪拥有高达23个参数设计，从单激光四色至六激光二十一色保证了优越的检测性能，并且符合FDA 21 CFR Part 11要求。

 贝克曼库尔特的CytoFLEX LX流式细胞仪

噬菌体展示技术拥有诸多优势，它实现了蛋白/多肽基因型与表型的统一，在蛋白质与其遗传基因之间建立了直接的物理联系；可以快速筛选得到所需抗体，通过这项技术不仅可以筛选到一般抗原的特异性抗体，也可以产生非免疫原性或毒性抗原的抗体，且所得到的抗体可以是Fab、scFv等，应用广泛。利用噬菌体展示技术生产单克隆抗体，生产快速，操作简便，效率更高，且可以进行人源化抗体的生产，具有较高的利用价值。

单个B细胞抗体技术作为新一代抗体开发技术，可以从单个B细胞中高效、快速的分离抗体，是继杂交瘤、噬菌体展示后又一抗体产生技术的突破。这种技术的特点，是“从打过胜仗的老兵身上找武器”。一是省去了先用抗原免疫小鼠这一步，二是不再依赖必须与骨髓瘤杂交的小鼠B细胞。有了这一段基因，无论插到什么细胞都可以培养并量产，其效果类似大肠杆菌生产基因重组人胰岛素。

典型的单个B细胞技术流程

它的主要流程为先从免疫动物或人的身上获取外周血单个核细胞，再进行抗原特异性结合B细胞的分选，接着通过PCR扩增技术得到单个B细胞抗体可变区基因，再通过载体构建获得抗体表达，最后进行产物验证。在此过程中，单个B细胞的分离是单B细胞技术最关键的步骤。目前有多种基于单细胞分离的技术，如磁珠分选法、微雕刻和ISAAC方法，流式分选法及微流控分选法等。

流式分选法是目前单B细胞技术应用较广泛的一种，它是基于抗原抗体的特异性反应，利用荧光素标记的B细胞表面分子的抗体以及标记的特异性抗原，通过多色流式分析与分选，筛选抗原特异性B细胞。流式分选可以直接将单个抗原特异性B细胞分选入细胞培养板的单孔中，进行后续的抗体基因扩增与测定。该技术优点：分离B细胞快速、准确、大量、多参数同时分析。

丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特的CytoFLEX SRT分选型流式细胞仪是新一代的高效细胞分选平台，适用于多色免疫分型，可进行稳定高表达细胞系的开发、单细胞测序应用等。CytoFLEX SRT流式细胞分选仪提供七种不同检测器配置，多达 15 种荧光颜色用于区分细胞群，能够区分细胞间的细微差异，多色应用超高灵敏度提高筛选精度；拥有4 路分选模式、混合分选模式、复杂分选逻辑等分选方式，能够捕捉其他分选液流中丢弃的细胞，并保存宝贵细胞。

贝克曼库尔特CytoFLEX SRT流式细胞分选仪

CytoFLEX SRT流式细胞分选仪使用垂直分选模式（Straight Down Mode），利用无电垂直向下的液流，而不是加载电荷的偏转液流。在进行单细胞索引分选时，使用这种模式可以在精确分选单细胞的同时获得更好地分选后活率。

贝克曼库尔特VICELL-XR评估

EL4小鼠T细胞淋巴瘤细胞的培养后活率

CytoFLEX SRT配套的数据获取和分析软件界面直观，方便多色分析；采用创新的设置、监测和液流维持系统，实现工作流自动化，节省研发者大量时间和精力。

CytEXPERT SRT软件界面

此外，美谷分子仪器的CloneSelect 高通量单细胞分离系统，基于微流控分离技术，使用专有的喷墨式一次性单向分离槽，可以轻柔而高效地分离单个细胞。该系统拥有高分辨率的明场和荧光成像，可以对细胞进行分选图像采集，获得单克隆的图像证据，具有潜在的单个B细胞分离的应用价值。

CloneSelect 高通量单细胞分离系统

     单细胞分选过程图像记录

通过单细胞分离技术获得的单个特异性B细胞，经过单细胞PCR技术从B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，并通过测序获得序列信息，再通过基因工程技术，进行载体构建、抗体表达和验证。