如何辅助ADC研发“精准制导”
2021-12-28 00:00 医麦客
2021年12月27日/医麦客新闻 eMedClub News/--近年来,抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugates,ADC)已在全球掀起研发浪潮,ADC具有靶向性强,毒副作用小等优点,可精准打击癌细胞,在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。Nature Reviews Drug Discovery 预计全球已上市 ADC 药物的市场规模到 2026 年将超过 164亿美元,
对于ADC,抗体的内化是一种强有力的作用机制,可以使ADC从靶细胞质膜上的结合位点转移至溶酶体内,从而激活并释放与其相连的毒性药物,最终杀死癌细胞。
抗体内化过程的效率与ADC的治疗指数直接相关。Invitrogen™ Molecular Probes™ 荧光标记和检测试剂以其在荧光标记领域的领先地位,整合了强大的pHrodo™ iFL技术、Zenon™标记技术和SiteClick™抗体标记技术,提供便捷高效且易于使用的抗体内化检测工具。
pHrodo™ iFL技术(经典氨基标记)
ADC内化过程会依次进入内涵体和溶酶体,周围pH逐渐酸化降低。pHrodo iFL是一种pH敏感的染料,在中性条件下无荧光信号,内化后在酸性pH环境下可发出强烈的荧光,并且可随pH值的减少而增强,因此对物质的细胞内吞清晰可见,能够便捷直观地在标记抗体后检测内化水平。
图1. 使用氨基反应性Invitrogen™ pHrodo™ iFL Red和pHrodo™ iFL Green制备的赫赛汀结合物的pH应答图谱。这些结合物在细胞外的中性pH下几乎无荧光,一旦内化进入细胞后可发出明亮的荧光。
图2.使用氨基反应性pHrodo™ iFL Red STP ester制备的赫赛汀结合物仅在内化至酸性细胞器内才发出荧光。使用Invitrogen™ CellLight™ Lysosomes-GFP和NucBlue™ Live ReadyProbes™试剂标记Her2+的SK-BR-3细胞,加入pHrodo™ iFL Red–赫赛汀处理18小时,在Invitrogen™ EVOS™ FL Auto成像系统上成像。
SiteClick™ 抗体标记技术(位点特异性)
SiteClick™ 抗体标记技术可以位点特异性地将荧光染料、小分子药物、生物素等连接至IgG抗体重链的N 糖基化位点上,远离抗原结合域,实现高重复性的标记。 图3. SiteClick标记步骤为使用酶修饰,然后通过点击化学反应连接标记物。SiteClick抗体标记过程的第一步是使用ß-半乳糖苷酶去除重链N-连接聚糖上的末端半乳糖残基,暴露可修饰的GlcNAc残基。第二步,使用GalT(Y289L)酶通过酶促反应将GalNAz连接至末端GlcNAc残基上,利用叠氮标签活化游离的末端GlcNAc残基。第三步,利用点击化学反应使叠氮残基与所选择的二苯环辛炔(sDIBO)-功能化探针(如Alexa Fluor 488 sDIBO炔烃)反应。
图4. SiteClick可实现高效、均匀且可重复的标记。28种不同抗体的DOL变异性 < 10% 。
Zenon™ 标记技术(快速,可高通量)
Zenon™ 标记技术提供了一种可靠的方法,结合pHrodo 染料可特异性靶向人或小鼠IgG抗体的Fc片段,并在10分钟内生成Zenon荧光标记抗体。该方法十分灵活,可用于筛选不同的抗体或不同抗体浓度,实现简便的规模化抗体内化筛选。
图5. 使用Zenon pHrodo iFL Red试剂标记的Rituximab被内化至CD20+细胞后可发出明亮的荧光,清晰指示了宽抗体浓度范围内的特异性抗体内化。使用三种不同浓度的Zenon pHrodo iFL Red试剂标记后,将不同浓度的Rituximab标记物加入CD20+细胞中,37°C孵育16小时,使用Attune NxT流式细胞仪检测信噪比。
图6. Zenon pHrodo iFL 试剂对所有IgG亚型都具有高亲和性,可特异性标记人IgG Fc段。
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